Liian paljon mallia pcr ssä

DNA: n kokonaismäärällä PCR: llä on merkittävä vaikutus PCR -menettelyn tulokseen. Liian suuren kokonais -DNA: n käyttäminen johtaa pakattuun DNA: han reaktioastian suljetussa tilassa ja voi johtaa vääriin alukkeisiin ja jopa heikkoon DNA -synteesiin suurten Taq -polymeraasimolekyylien esteen vuoksi.

1. Kuinka paljon mallia minun pitäisi lisätä PCR: ään?
2. Voiko liika aluke estää PCR: ää?
3. Mikä voi aiheuttaa PCR -reaktion epäonnistumisen?
4. Kuinka paljon DNA: ta riittää PCR: ään?

Kuinka paljon mallia minun pitäisi lisätä PCR: ään?

Vaikka teoriassa yksi templaatin molekyyli riittäisi, klassiseen PCR: ään käytetään tyypillisesti huomattavasti suurempia määriä DNA: ta, esimerkiksi enintään 1 µg nisäkkäiden genomista DNA: ta ja vain 1 pg plasmidi -DNA: ta (1).

Voiko liika aluke estää PCR: ää?

DNTP -seoksen epäpuhtaudet voivat johtaa epätäydelliseen tai virheelliseen monistukseen tai PCR -inhibitioon. Käytä korkealaatuisia dNTP-protokollia. Alukkeiden liiallisen pitoisuuden käyttö voi lisätä mahdollisuutta sitoutua alukkeisiin epäspesifisesti mallin ei -toivottuihin kohtiin tai toisiinsa.

Mikä voi aiheuttaa PCR -reaktion epäonnistumisen?

Vain yhden PCR -reaktion komponentin unohtaminen, olipa se sitten DNA -polymeraasi, alukkeet tai jopa templaatti -DNA, johtaa epäonnistuneeseen reaktioon. Yksinkertaisin ratkaisu on toistaa reaktio. ... Jos PCR -tuotetta ei vieläkään ole tämän jälkeen, on todennäköistä, että jokin muu estää reaktiota.

Kuinka paljon DNA: ta riittää PCR: ään?

Tyypillisessä 50 µL reaktiossa 1-2 yksikköä DNA -polymeraasia riittää kohde -DNA: n monistamiseen. Entsyymimääriä voi kuitenkin olla tarpeen säätää vaikeilla malleilla. Esimerkiksi kun inhibiittoreita on läsnä DNA -näytteessä, DNA -polymeraasin määrän lisääminen voi parantaa PCR -saantoja.