Takara pcr vianmääritys

Sen sijaan PCR -olosuhteet on optimoitava; Ota huomioon seuraavat asiat PCR -ehtoja säätäessäsi:

1. Vähennä mallin määrää.
2. Nosta hehkutuslämpötila.
3. Käytä touchdown -PCR: ää.
4. Vähennä PCR -jaksojen määrää.
5. Suunnittele alukkeet uudelleen.
6. Käytä sisäkkäisiä alukkeita.
7. Vahvista tuotetta uudelleen.

1. Miksi PCR ei toimi??
2. Kuinka optimoit PCR -olosuhteet?
3. Mikä aiheuttaa tahroja PCR: ssä?
4. Mistä tietää, onko PCR saastunut??

Miksi PCR ei toimi??

Vain yhden PCR -reaktion komponentin unohtaminen, olipa se sitten DNA -polymeraasi, alukkeet tai jopa templaatti -DNA, johtaa epäonnistuneeseen reaktioon. Yksinkertaisin ratkaisu on toistaa reaktio. ... Jos PCR -tuotetta ei vieläkään ole tämän jälkeen, on todennäköistä, että jokin muu estää reaktiota.

Kuinka optimoit PCR -olosuhteet?

PCR -olosuhteet

1. Käytä korkeampia denaturointilämpötiloja (esim.g., 98 ° C, toisin kuin 94 ° C tai 95 ° C) templaatin täydellisen denaturoinnin mahdollistamiseksi.
2. Pidä GC-rikkaiden mallien hehkutusajat mahdollisimman lyhyinä.
3. Käytä alukkeita, joilla on korkeampi T_m (>68 ° C), koska hehkutus voi tapahtua korkeammassa lämpötilassa.

Mikä aiheuttaa tahroja PCR: ssä?

DNA -kontaminaatio, RNA DNA -näytteessä, DNA: n korkea pitoisuus PCR -reaktiossa voi aiheuttaa tahroja. ... Yleensä DNA: n tahrautuminen johtuu kasveista templaatti -DNA: n suuren pitoisuuden vuoksi.

Mistä tietää, onko PCR saastunut??

Tarkista liuoksen kontaminaatio kokoamalla negatiiviset kontrollireaktiot käyttämällä uusia reagensseja, joiden ei tiedetä saastuneen, ja lisää yksi epäillyistä liuoksista kuhunkin reaktioon. Tämä reaktio osoittaa monistuneita tuotteita, jotka viittaavat kontaminaatioon, on todiste siitä, että lisätty liuos oli saastunut.