Topmusicanswers
PCR- ja RT-PCR-vahvistuksen vianmääritys
| Ongelma | Mahdollinen syy |
|---|---|
| Ei nauhoja geelissä | Jatkoaika oli liian lyhyt |
| Lämpösykli ei ollut oikeassa lämpötilassa | |
| Ylimääräiset, epäspesifiset nauhat geelissä | Alukkeet hybridisoituvat mallin toissijaiseen kohtaan |
| DNA -kontaminaatio lisättiin alukkeisiin tai puskureihin |
- Mikä aiheuttaa PCR -epäonnistumisen?
- PCR -ongelman vianmääritys?
- Mitä tekisit, jos näytteen PCR -monistus epäonnistuu?
- Mitä tapahtuu, kun lisäät liikaa aluketta PCR: ään?
Mikä aiheuttaa PCR -epäonnistumisen?
Yleensä ensimmäinen asia, jonka tutkijat tekevät, on syyttää viallista entsyymiä tai reagenssia, kun koe epäonnistuu, mutta PCR: llä tämä on itse asiassa vähemmän todennäköistä epäonnistumisen syy. Usein syvemmät sisäiset ongelmat, kuten alukkeen suunnittelu, lämpösykleriparametrit tai epäspesifinen sitoutuminen muihin templaattisekvensseihin, ovat syy.
PCR -ongelman vianmääritys?
Tarkista valittujen DNA -polymeraasien monistuspituus. Käytä DNA -polymeraaseja, jotka on erityisesti suunniteltu pitkälle PCR: lle. Valitse korkean prosessiviteetin omaavia DNA -polymeraaseja, jotka voivat monistaa pitkiä kohteita lyhyemmässä ajassa. Vähennä hehkutus- ja pidennyslämpötiloja, jotta aluke sitoutuu ja entsyymin lämpöstabiilisuus paranee.
Mitä tekisit, jos näytteen PCR -monistus epäonnistuu?
Jos monistusreaktio epäonnistuu ja epäilet, että DNA -templaatti on saastunut inhibiittorilla, lisää epäilty DNA -valmiste kontrollireaktioon, jossa on aiemmin hyvin monistunut DNA -templaatti ja alukepari .
Mitä tapahtuu, kun lisäät liikaa aluketta PCR: ään?
Suurempien alukekonsentraatioiden käytöllä voi olla seuraavat vaikutukset: Jos alukkeet pystyvät muodostamaan dimeerejä, niiden pitoisuuden nostaminen johtaa vain alukedimeerien muodostumiseen eikä paranna halutun PCR-tuotteen monistusta.
