Vahvistusongelmat

1. Mitä ongelmia PCR -monistuksesta voi syntyä??
2. Miksi PCR: ssä ei ole vahvistusta??
3. Mikä aiheuttaa monistumisen PCR: ssä?
4. Mikä aiheuttaa PCR -epäonnistumisen?

Mitä ongelmia PCR -monistuksesta voi syntyä??

Monet PCR: n ja RT-PCR: n yleisistä ongelmista tunnistetaan reaktiotuotteiden agaroosigeelielektroforeesin aikana. Näitä ovat odotetun monistustuotteen puuttuminen, epäspesifisten tuotteiden läsnäolo, liiallinen tahraantuminen ja "alukkeen dimeerikaista".

Miksi PCR: ssä ei ole vahvistusta??

DNA -polymeraasientsyymi ei toimi

DNA -polymeraasientsyymi on vastuussa sitoutuneiden alukkeiden pidentymisestä templaatin DNA -juosteita pitkin. Jos tämä entsyymi ei ole enää yhtä tehokas, ehkä jäätymisen ja sulamisen vuoksi, jatko-vaihe PCR-reaktion aikana on epätäydellinen, jolloin et saa PCR-tuotetta.

Mikä aiheuttaa monistumisen PCR: ssä?

Perus -PCR. PCR -prosessi kehitettiin alun perin monistamaan pidemmän DNA -molekyylin lyhyitä segmenttejä (Saiki et ai. 1985). Tyypillinen monistusreaktio sisältää kohde -DNA: n, lämpöstabiilin DNA -polymeraasin, kaksi oligonukleotidialuketta, deoksinukleotiditrifosfaatit (dNTP: t), reaktiopuskurin ja magnesiumin.

Mikä aiheuttaa PCR -epäonnistumisen?

Yleensä ensimmäinen asia, jonka tutkijat tekevät, on syyttää viallista entsyymiä tai reagenssia, kun koe epäonnistuu, mutta PCR: llä tämä on itse asiassa vähemmän todennäköistä epäonnistumisen syy. Usein syvemmät sisäiset ongelmat, kuten alukkeen suunnittelu, lämpösykleriparametrit tai epäspesifinen sitoutuminen muihin templaattisekvensseihin, ovat syy.